Toteuta virtaussytometrit nopeasti käyttämällä huipputarkkoja tiedonkeruumoduuleja

Kirjoittaja Bonnie Baker

Julkaisija Digi-Keyn kirjoittajat Pohjois-Amerikassa

Lääkärit ja diagnosoijat käyttävät yleisesti virtaussytometriaa solujen ominaisuuksien analysointiin. He arvioivat solu kerrallaan optisesti muun muassa proteiinipitoisuuksia, veren terveyttä, rakeisuutta ja solukokoa. Vaikka sytometrit ovat erittäin herkkiä järjestelmiä, niiden suunnittelijoilla on jatkuvasti haasteena nopeuttaa analyysiaikaa. Tämä edellyttää uusia lähestymistapoja sekä virtaussytometriassa että siihen liittyvässä elektroniikassa.

Sytometrit altistavat yksittäisiä soluja laservalolle ja tuottavat näin sironta- ja fluoresenssisignaaleja. Syntyvän valon nopea ja tarkka vangitseminen ja muuntaminen digitaalisiksi signaaleiksi edellyttää vyöryvalodiodia (APD) ja kompleksista elektroniikkaa. Piirien suunnittelu ja toteuttaminen tätä prosessia varten voi viedä paljon aikaa, varsinkin kun otetaan huomioon, että virtaussytometrian tiedonkeruujärjestelmät ja järjestelmän tarkkuus edellyttävät huippunopeita ja kohinaltaan alhaisia laitteita.

Jotta nopeampi virtaussytometria-analyysi voitaisiin toteuttaa kustannustehokkaasti, suunnittelijat voivat ratkaista nopeuteen ja tarkkuuteen liittyvät ongelmat tiedonkeruusovelluksella, joka muodostuu sisäisistä vahvistinajureista ja analogi-digitaalimuuntimesta (ADC).

Tässä artikkelissa esitetään lyhyesti, miten virtaussytometriajärjestelmät toimivat. Sen jälkeen siinä esitellään Analog Devices ADAQ23878, 18-bittinen analogi-digitaalimuunninmoduuli, ja näytetään, miten sitä voidaan käyttää virtaussytometrin detektointi- ja muuntovaiheen suunnittelussa. Lisäksi artikkelissa esitellään siihen liittyvä evaluointisarja.

Nykyaikaisen virtaussytometrian periaatteet

Nykyaikainen virtaussytometria on automatisoitu prosessi, jossa analysoidaan solu- ja pintamolekyylejä sekä karakterisoidaan ja määritellään heterogeenisen solupopulaation eri solutyyppejä. Lukuun ottamatta valmisteluaikaa, joka voi kestää yli tunnin, laite suorittaa 10 000 yksittäisen solun 3–6 ominaisuuden arvioinnin alle minuutissa.

Jotta tämä olisi mahdollista, virtaussytometrian yksittäisten solujen valmisteluvaihe on ratkaisevan tärkeä. Näytteiden järjestäminen tapahtuu vaippaliuoksessa hydrodynaamisesti, jossa solut tai partikkelit fokusoidaan kapeaksi yhden solun näytevirraksi analysointia varten. Tässä muunnoksessa yksittäisten solujen on säilytettävä luonnolliset biologiset ominaisuutensa ja biokemialliset komponenttinsa.

Kuvassa 1 esitetään kaavio virtaussytometrista, joka alkaa ylhäältä monisolunäytteestä.

Kaavio virtaussytometristä, vaipassa fokusoinnista tiedonkeruuseen (suurenna klikkaamalla)Kuva 1: Virtaussytometrin kaavio vaipassa fokusoinnista tiedonkeruuseen saakka. (Kuvan lähde: Wikipedia, muokannut Bonnie Baker)

Virtaussytometrin kuusi pääkomponenttia ovat virtaussolu, laser, vyöryvalodiodi (APD), transimpedanssivahvistin (TIA), analogi-digitaalimuunnin ja tietokone tiedonkeruuta ja -analysointia varten.

Virtaussytometrissä kulkee nestevirta, jota kutsutaan myös vaippaliuokseksi, ja joka on kavennettu solujen kuljettamiseksi ja kohdistamiseksi yhtenäisenä rivinä valonsäteen läpi. Laservalo osuu yhteen soluun kerrallaan ja synnyttää eteenpäin siroavan valon (FSC) signaalin ja sivulle siroavan valon (SSC) signaalin. Fluoresenssivalo lajitellaan peilien ja suodattimien avulla, minkä jälkeen sitä vahvistetaan vyöryvalodiodilla.

Kun valo on osunut vyöryvalodiodiin, se mitataan, digitalisoidaan ja analysoidaan. 500 megahertsin (MHz) FET-tuloa käyttävä operaatiovahvistin Analog Devices LTC6268 on erittäin alhaisella biasvirralla ja alhaisella jännitekohinalla ihanteellinen detektointiin tarvittavaan huippunopeaan transimpedanssivahvistimeen.

Kaavio transimpedanssivahvistinpiiristä, jossa käytetään vyöryvalodiodia (PD1) ja alhaisen tulovirran FET-operaatiovahvistintaKuva 2: Transimpedanssivahvistinpiirissä käytetään vyöryvalodiodia (PD1) sekä alhaisen tulovirran FET-operaatiovahvistinta erittäin alhaisten valodiodivirtojen muuntamiseen lähtöjännitteeksi IN1+. (Kuvan lähde: Bonnie Baker)

On tärkeää suunnitella tämä vahvistinpiiri mahdollisimman laajalle kaistanleveydelle, joten loiskapasitanssit on minimoitava. Esimerkiksi takaisinkytkentäloiskapasitanssi C vaikuttaa kuvan 2 piirin stabiiliuteen ja kaistanleveyteen. Vahvistimen takaisinkytkentätiellä on aina loiskapasitanssia riippumatta siitä millainen vastuskotelo valitaan. Huippunopeisiin sovelluksiin suositellaan kuitenkin 0805-koteloa, jossa kytkentäkohtien välinen etäisyys on pidempi ja joka tarjoaa pienimmän loiskapasitanssin.

Vastuksen R1 kytkentäkohtien välisen etäisyyden kasvattaminen ei ole ainoa tapa pienentää kapasitanssia. Toinen tapa pienentää levyjen välistä kapasitanssia on suojata loiskapasitanssin aiheuttavat sähkökentän reitit sijoittamalla ylimääräinen maadoitusjohdin vastuksen R1 alle (kuva 3).

Kaavio maadoitusjohtimen lisäämisestä takaisinkytkennän alle.Kuva 3: Maadoitusjohtimen lisääminen takaisinkytkentävastuksen alle johtaa sähkökentän pois takaisinkytkentäpuolelta ja kytkee sen maahan. (Kuvan lähde: Analog Devices)

Tässä tapauksessa menetelmään kuuluu erityisesti lyhyen maadoitusjohtimen sijoittaminen transimpedanssivahvistimen lähtöpään lähellä olevien vastusten liitoskohtien alle ja väliin. Tällä tekniikalla loiskapasitanssin arvoksi saadaan 0,028 pikofaradia (pF), kun transimpedanssivahvistimen kaistanleveys on 1/(2π*RF*CPARASITIC) eli 11,4 MHz.

Optiset valosignaalit kohdistetaan useisiin vyöryvalodiodeihin sopivien optisten suodattimien läpi. Vyöryvalodiodi-, transimpedanssivahvistin- ja analogi-digitaalimuunninjärjestelmä muuntaa nämä signaalit digitaaliseen muotoon ja lähettää datan mikroprosessorille jatkoanalyysiä varten.

Nykyaikaisissa laitteissa käytetään yleensä useita lasereita ja analogi-digitaalimuuntimia. Tällä hetkellä myytävänä olevissa laitteissa on kymmenen laseria ja kolmekymmentä vyöryvalodiodia. Laserien ja valomonistinilmaisimien määrän lisääminen mahdollistaa useiden vasta-aineiden merkitsemisen, jotta kohdepopulaatiot voidaan detektoida tarkasti fenotyyppisten merkkiaineiden avulla.

Analyysin nopeus riippuu kuitenkin seuraavien tekijöiden välisestä erittäin hienosta tasapainosta:

  • vaippaliuoksen nopeus
  • hydrodynaamisen fokusointiprosessin kyky muodostaa yhden solun virtoja
  • tunnelin halkaisija
  • kyky säilyttää solun eheys
  • elektroniikka.

Virtaussytometrian akustinen fokusointi

Vaikka lasereiden ja vyöryvalodiodien lisääminen nopeuttaa analyysiä ja detektointia, nykyaikaisimmat yhden solun virtaussytometriamenetelmät voivat parhaimmillaan kerätä dataa enintään miljoonasta yksittäisestä solusta minuutissa. Monissa sovelluksissa tämä ei riitä, esimerkkinä veressä kiertävien kasvainsolujen detektointi, jos niitä on vain 100 solua millilitraa kohti. Harvinaisiin soluihin liittyvissä kliinisissä sovelluksissa testit vaativat usein miljardien solujen analysointia, mikä vie paljon aikaa.

Akustinen fokusointiprosessi tarjoaa vaihtoehdon hydrodynaamisesti fokusoidulle solujen valmisteluprosessille. Tässä pietsosähköinen materiaali, kuten lyijy-zirkonaatti-titanaatti (PZT), kiinnitetään lasikapillaariin sähköpulssien muuntamiseksi mekaanisiksi värähtelyiksi (kuva 4a). Kun lasikapillaarin sivuseinämät saadaan lyijy-zirkonaatti-titanaatilla värähtelemään suorakulmaisen virtaussolun resonanssitaajuudella, järjestelmässä muodostuu erilaisia akustisia seisovia aaltoja, jotka sisältävät vaihtelevan määrän painesolmuja.

Kuva suorakulmaisella lasikapillaarilla toteutetusta akustisesta virtaussolustaKuva 4: Kuva suorakulmaisella lasikapillaarilla toteutetusta akustisesta virtaussolusta (a). Kolmen ensimmäisen painesolmun sijainti tietyn levyisessä kapillaarissa (b). (Kuvan lähde: National Center for Biotechnology Information)

Nämä lyijy-zirkonaatti-titanaatilla synnytetyt taajuussolmut ohjaavat virtaavat partikkelit useisiin erillisiin virtauslinjoihin (kuva 4b). Akustinen virtaussolu käyttää lineaarista seisovaa akustista aaltoa ja virittyy eri aallonpituuksille luoden yksittäisiä tai useita harmonisia aaltoja. Näytteeseen sisältyvät solut muodostavat virtauskammiossa yksittäisiä tai useita yksittäisten solujen linjoja yksinkertaisen lineaarisen seisovan aallon mallin ennusteen mukaisesti.

Solujen tarkan järjestymisen ansiosta vaippaliuostunnelin leveyttä voidaan kasvattaa ja lasersäteen ohi kulkevan nesteen virtausnopeutta voidaan nostaa (kuva 5).

Kaavio akustisesti fokusoiduista näytevirrasta ja hydrodynaamisesta näytevirrasta (suurenna klikkaamalla).Kuva 5: Hydrodynaamisessa näytevirrassa (c. ja d.) vaippaleveyden kasvattaminen vaikeuttaa optista mittausprosessia, koska solunäytteet hajaantuvat. Akustisesti fokusoiduilla näytevirroilla (a. ja b.) soluvirrat pysyvät yhdessä rivissä vaipan leveydestä riippumatta. (Kuvan lähde: Thermo Fischer Scientific)

Perinteisessä hydrodynaamisessa fokusoinnissa (kuva 5c.) yhden solun rivit järjestetään valmiiksi laserskannausta varten. Vaikka leveämpi suppilo näytevirran ytimessä mahdollistaa vaippamateriaalin korkeamman nopeuden (kuva 5d.), se johtaa myös yksisolujärjestyksen leviämiseen, mikä sekoittaa signaalia ja laskee datan laatua.

Akustinen fokusointi (kuva 5a.) ohjaa biologiset solut ja muut partikkelit tarkasti haluttuun kohtaan, vaikka tunneli olisikin leveämpi. Tämä solujen tarkka kohdistus mahdollistaa korkeammat näytteenottonopeudet säilyttäen datan laadun korkeana (kuva 5b.).

Virtaussytometrian akustinen fokusointi nostaa solujen näytteenottotaajuuden käytännössä noin 20-kertaiseksi (kuva 6).

Kuva näytteenottoaikojen vertailusta eri virtaussytometreilläKuva 6: Näytteenottoaikojen vertailu eri virtaussytometreillä, A, B ja C perustuvat nestevirtaussytometriaan ja D akustiseen fokusointisytometriaan. (Kuvan lähde: Thermo Fischer Scientific)

Kuvassa 6 laitteet A, B ja C käyttävät hydrodynaamista tekniikkaa, kun taas D käyttää akustista fokusointisytometriaa.

Tiedonkeruu akustisessa fokusointivirtaussytometriassa

Akustisen fokusointivirtaussytometrialaitteiston elektroniikan suunnittelu vaatii huippunopeaa valodetektorielektroniikkaa, jotta verisolujen ja vaippaliuoksen nopeus on hallittavissa halkaisijaltaan suuremman suuttimen läpi. Edellä mainittu huippunopea 600 MHz:n operaatiovahvistin LTC6268 erityiseen 0805-vastuskoteloon yhdistettynä mahdollistaa jopa 11,4 MHz:n (kuva 7, vasemmalla) optisen tunnistusnopeuden. Operaatiovahvistimen LTC6268 lähtö syötetään Analog Devices ADAQ23878 -analogi-digitaalimoduuliin digitalisointia varten.

Kaavio Analog Devices ADAQ23878 -analogi-digitaalimuuntimesta (suurenna klikkaamalla)Kuva 7: Analogi-digitaalimuunnin ADAQ23878 digitalisoi valodiodista (PD1) ja transimpedanssivahvistinpiiristä (vasemmalla) saadun optisen signaalin. (Kuvan lähde: Bonnie Baker)

ADAQ23878 on 18-bittinen, 15 miljoonaa näytettä sekunnissa (MSPS) tarjoava tarkka ja huippunopea SIP (System-in-Package) -tiedonkeruuratkaisu. Se lyhentää huomattavasti tarkkojen mittausjärjestelmien kehityssykliä siirtämällä tulo-ohjainkomponenttien valintaan, optimointiin ja layoutiin liittyvän suunnittelutaakan suunnittelijalta laitteelle.

SIP-ratkaisun modulaarinen lähestymistapa vähentää loppujärjestelmän komponenttien määrää, koska yksi ainoa komponentti tarjoaa useita yhteisiä signaalinkäsittely- ja signaalinparannuslohkoja, mukaan lukien huippunopea 18-bittinen 15 miljoonaa näytettä sekunnissa (MSPS) tarjoava SAR (Successive Approximation Register) -rekisteriä käyttävä analogi-digitaalimuunnin. Näihin lohkoihin kuuluvat kohinaltaan alhainen täysin differentiaalinen analogi-digitaalimuuntimen ohjausvahvistin sekä stabiili referenssipuskuri.

ADAQ23878 sisältää myös kriittiset passiivikomponentit, jotka käyttävät Analog Devices -yrityksen iPassive-tekniikkaa lämpötilasta riippuvaisten virhelähteiden minimointiin ja suorituskyvyn optimointiin. Analogi-digitaalimuuntimen nopeasti asettuva ohjainaste edistää osaltaan nopeaa tiedonkeruuta.

ADAQ23878 µModule -tuotteen arvioiminen

Analog Devices tarjoaa ADAQ23878-piirin arviointiin EVAL-ADAQ23878FMCZ-arviointikortin (kuva 8). Kortti esittelee ADAQ23878 μModulen suorituskykyä ja tarjoaa monipuolisen työkalun virtaussytometrian etuasteen suunnittelun evaluointiin ja moniin muihin sovelluksiin.

Kuvassa Analog Devices EVAL-ADAQ23878FMCZ -evaluointikortti ADAQ23878 μModulea vartenKuva 8: ADAQ23878-μModulen EVAL-ADAQ23878FMCZ-evaluointikortti sisältää tehokomponentit ja SDP-H1-yhteensopivan kortin mukana toimitetaan korttia vastaava ohjelmisto ohjausta ja data-analyysiä varten. (Kuvan lähde: Analog Devices)

EVAL-ADAQ23878FMCZ-evaluointikortti vaatii tietokoneen, jossa on Windows 10 tai uudempi käyttöjärjestelmä, vähäkohinaisen tarkkuussignaalilähteen sekä 18-bittiseen testaukseen soveltuvan kaistanpäästösuodattimen. Evaluointikortti tarvitsee ADAQ23878 ACE -lisäosan ja SPD-H1-ajurin.

Yhteenveto

Yhden biologisen solun tutkiminen kerrallaan tavanomaisilla hydrodynaamisilla fokusointivirtaussytometrian tekniikoilla on ollut menestyksekästä, mutta nopeamman analyysin tarve on aiheuttanut siirtymistä tekniikoihin, jotka perustuvat akustisiin fokusointivirtausmenetelmiin. Edistyneempi virtaussytometria vaatii kuitenkin puolestaan parempaa elektroniikkaa. Samalla tila, kustannukset ja kehitysaika tulisi minimoida.

Kuten edellä on esitetty, huippunopea operaatiovahvistin LTC6268 ja tarkka, nopea tiedonkeruuratkaisu μModule ADAQ233878 voidaan yhdistää täydelliseksi tiedonkeruujärjestelmäksi edistyneitä virtaussytometrialaitteita varten.

Disclaimer: The opinions, beliefs, and viewpoints expressed by the various authors and/or forum participants on this website do not necessarily reflect the opinions, beliefs, and viewpoints of Digi-Key Electronics or official policies of Digi-Key Electronics.

Tietoja kirjoittajasta

Bonnie Baker

Bonnie Baker on hyvin kokenut analogitekniikan, sekasignaalien ja signaaliketjujen ammattilainen ja sähköinsinööri. Baker on kirjoittanut ja julkaissut satoja teknisiä artikkeleita, EDN-kolumneja sekä tuotekuvauksia alan julkaisuissa. Kirjoittaessaan kirjan “A Baker's Dozen: Real Analog Solutions for Digital Designers” ja ollessaan mukana kirjoittamassa useita muita kirjoja hän työskenteli suunnittelijana sekä mallinnuksessa ja strategisessa markkinoinnissa yrityksillä Burr-Brown, Microchip Technology, Texas Instruments ja Maxim Integrated. Baker on suorittanut sähkötekniikan yliopistotutkinnon Arizonan Yliopistossa Tucsonissa sekä kandidaatintutkinnon musiikinopetuksessa Pohjois-Arizonan Yliopistossa (Flagstaff, AZ). Hän on suunnitellut, kirjoittanut ja esittänyt verkkokursseja lukuisista teknisistä aiheista, mukaan lukien AD-muuntimet, DA-muuntimet, operaatiovahvistimet, instrumentaatiovahvistimet, SPICE- sekä IBIS-mallinnus.

Tietoja tästä julkaisijasta

Digi-Keyn kirjoittajat Pohjois-Amerikassa